RNA interferentie in de bijenteelt

Bron: Maandblad van de Vlaamse Imkersbond
Jaar: 2019
Maand: Maart
Auteurs: Ghislain De Roeck

RNA interferentie in de bijenteelt

De komst van de varroamijt confronteerde ons pijnlijk met het bestaan van bijenvirussen. Toch is hun immuunsysteem uitgerust om er zich tegen te verdedigen. Bovendien is er extra hulp onderweg. Wetenschappers zoeken uit hoe RNA-interferentie (RNAi) virus- en varroazieke volken zou kunnen genezen. De materie is soms een beetje moeilijk, maar nu de moleculaire wetenschap haar intrede deed in onze sector, is het best dat we ons stilaan op deze weg begeven.

Blik in de cel

Eerst even wat genetica. Bijen en mensen bestaan uit cellen, van mensen bv. weten we dat ze er zo’n tienduizend miljard van bezitten. Die cellen hebben een membraan dat het cytoplasma omgeeft waarin zich diverse structuurtjes bevinden, organellen geheten, zoals de celkern en de ribosomen. Voor deze bijdrage beperken we ons tot die twee.

De celkern bevat het DNA, de belangrijkste drager van erfelijke informatie. DNA is overigens de afkorting van ‘desoxyribonucleic acid’, in het Nederlands desoxyribonucleïnezuur. Watson en Crick ontsloten de geheimen van het DNA en ontvingen er in 1953 de Nobelprijs voor. Ze ontdekten dat een DNA-molecuul er uitziet als een dubbele helix, een soort wenteltrap zeg maar. Vandaar dat we soms lezen over ‘dubbelstrengig DNA’, in tegenstelling tot het obligaat enkelstrengig RNA in het cytoplasma. RNA, van ribonucleïnezuur, is een molecuul dat essentieel is voor de regeling van cellulaire processen: het speelt een belangrijke rol in het tot expressie brengen van genen.

De treden van de wenteltrap bestaan steeds uit twee van vier basen: A(denine), T(hymine), C(ytocine) of G(uanine). Een A is gekoppeld aan een T, een C aan een G. We noemen A, T, C en G de letters van het DNA. In het RNA is Thymine vervangen door Uracil.

Een suiker, desoxyribose voor DNA, en een fosfaatzuur vormen de trapleuning (zie afb. 1). Eén base, het suiker en het zuur samen kregen de wat duur klinkende naam ‘nucleotide’. Het is de basiseenheid van het DNA die dus in vier varianten kan voorkomen. Genen bestaan uit een aantal nucleotiden die elkaar in een bepaalde volgorde, of sequentie, opvolgen.

DNA bevindt zich in de cellen onder de vorm van chromosomen waarvan wij er 46 hebben, 23 van moederskant en 23 van vaderskant. Werksters en koninginnen bezitten er 32, darren slechts 16 omdat ze geen vader hebben. Op elk chromosoom zitten meerdere genen die info bevatten voor de aanmaak van de vele eiwitten die een organisme nodig heeft om te functioneren. Eiwitten hebben verschillende functies. Het kunnen bouwstoffen zijn die groei mogelijk maken, enzymen die chemische reacties vergemakkelijken of afweerstoffen tegen ziekmakende micro-organismen. Een eiwit is een aaneenschakeling van aminozuren, essentiële en niet-essentiële. De essentiële moeten, voor wat onze bijen betreft, uit het stuifmeel komen. Dat is ook de reden waarom stuifmeel zo belangrijk voor hen is. Via de vertering komen de aminozuren in het bijenbloed terecht en van daaruit gaat het richting cellen.

Het aanmaken van de eiwitten is de zaak van de ribosomen (zie fig. 2). Zoals we zagen, situeert DNA zich in de celkern en kan deze niet verlaten. De ribosomen van hun kant horen thuis in het cytoplasma en hebben geen toegang tot de celkern. Er is dus communicatie nodig tussen beide. De basis van deze communicatie is het zogenaamde messenger RNA (mRNA), de bekendste vorm van RNA. mRNA is enkelstrengig maar heeft het potentieel dubbelstrengig te worden als er een streng met de juiste nucleotidensequentie wordt aan vastgehecht. Dat gegeven staat centraal in het hele interferentieproces, zoals zal blijken uit wat volgt. Op het mRNA kopieert het systeem de codes voor een eiwit zoals dat in de genen beschreven staat. Dat heet ‘transcriptie’. Daarna verlaat het mRNA de celkern via de poriën en begeeft zich naar de ribosomen waar de ‘translatie’, de vertaling, tot eiwit gebeurt. Vergelijk het overschrijven van de code van een gen naar mRNA, het transport van dat mRNA naar de ribosomen en de ‘vertaling’ aldaar van de code met een bezoek aan de dokter: die stelt een diagnose en schrijft een voorschrift (transcriptie) waarmee je dan naar de apotheker (ribosomen) gaat. Die maakt het geneesmiddel zelf aan of heeft het kant-en-klaar liggen in zijn apotheek (translatie).

Wat is RNA-interferentie?

RNA-interferentie (RNAi) is een natuurlijk verschijnsel dat voorkomt in de cellen van alle wezens waarvan de cel een kern bevat. De werking van RNAi berust op het blokkeren van mRNA waardoor de ribosomen het niet kunnen vertalen in eiwitten. Hiertoe moet in het cytoplasma van de cel op de een of andere manier een stukje enkelstrengs RNA ingebracht worden met een opeenvolging van nucleotiden die past bij het uit te schakelen mRNA.

Zoals vaak in de biologie komen er variaties voor op dat thema.

De genetische informatie van bijenvirussen zit niet op dubbelstrengig DNA maar op enkelstrengig RNA, vergelijkbaar met mRNA. Om zich te vermenigvuldigen kapen virussen een cel van hun slachtoffer en injecteren hun genoom in zijn cytoplasma. Ribosomen kunnen geen onderscheid maken tussen het RNA dat ze via transcriptie van de eigen genen aangereikt krijgen, het mRNA dus, en het RNA van de virussen. Ze ervaren deze enkele streng als normaal mRNA en vertalen hem in een eiwitketen. De cel bevat dan virale eiwitten. Dat is een noodzakelijke voorwaarde om het immuunsysteem van de bij te kunnen ontwrichten en de ribosomen aan te zetten om nog meer virusdeeltjes te vervaardigen. Dat vergt echter een soort mal of matrijs. Hiervoor maken de viruseiwitten een kopie aan van de originele RNA-streng van het virus waarna ze beide, origineel en kopie, samenvoegen. Als ze dat voor mekaar hebben bevat het cytoplasma echter een dubbele RNA-streng (dsRNA), een anomalie die de cel meteen herkent en waartegen ze weerwerk biedt: ze activeert het enzym Dicer dat de dsRNA-streng in korte stukken knipt. Het enzym start vervolgens het zogenaamde RNA-induced silencing complex (RISC) op, een proces dat alle sporen van de virusaanval opruimt en daarom essentieel is in het RNAi-gebeuren.

Aangenomen wordt dat bijen waarvan het immuunsysteem verzwakt is dat proces niet spontaan op gang kunnen brengen. Dan kan het virus zich in een mum van tijd vele keren vermenigvuldigen. Dat leidt tot de dood van de aangevallen cel en de besmetting van naburige cellen. Ultiem kan het organisme zelf er het loodje bij neerleggen.

Nobelprijs

In 1998 onderzochten Fire en Mello hoe ze bij het wormpje Caenorhabditis elegans interfererend RNA het best in de cellen konden brengen. Tot hun verrassing ontdekten ze dat dsRNA substantieel effectiever was in het produceren van interferentie dan één afzonderlijke RNA-streng. Na injectie in volwassen dieren had enkelstrengige RNA weliswaar een bescheiden effect, maar dsRNA veroorzaakte krachtige en specifieke interferentie. De effecten van deze interferentie waren duidelijk (Fire et al., 1998). Later onderzoek toonde aan dat actief RNA doorgegeven wordt aan het nageslacht, wellicht via de voedster- en koninginnenbrij (Maori et al., 2018).

Sinds de ontdekking hiervan is RNA-interferentie een belangrijk onderzoeksgebied geworden onder zowel biologen als medici. De techniek biedt namelijk talrijke mogelijkheden voor de ontwikkeling van een nieuwe generatie geneesmiddelen voor allerlei aandoeningen waaronder kanker en erfelijke ziekten.

Fire en Mello kregen voor hun werk over RNAi de Nobelprijs Fysiologie of Geneeskunde in 2006.

Beeologics …

Intussen stelden onderzoekers zich de vraag wat de technologie voor de bijen en hun virussen kon betekenen. Een bedrijf uit Israël, Beeologics, kwam als eerste met een plan. Zijn voorzitter, Eyal Ben-Chanoch, wist eigenlijk niet veel over bijen toen de bijensterfte (CCD) in Amerika toesloeg, halverwege de vorige decade. Maar hij wist dat imkers er zich heel veel zorgen over maakten en dacht dat een middel dat de ziekte kon counteren zijn bedrijf internationale belangstelling zou opleveren. Dus gaf hij zijn onderzoekers de opdracht uit te vissen of de RNAi-technologie geschikt kon zijn om het Israëlisch acuut verlammingsvirus, volgens sommigen toen de oorzaak van CCD, onder controle te brengen. En inderdaad, de onderzoekers slaagden erin lange dubbelstrengige kopieën van de RNA-streng van het virus aan te maken en noemden het product ‘Remebee’. Ze voedden het aan proefvolken in suikersiroop en konden zodoende de natuurlijke virusafweer van de bijen op gang brengen. Vergelijk dit met hoe vaccins in ons lichaam werken.

Ben-Chanoch leerde in die fase van de ontwikkeling Jerry Hayes kennen en stelde hem Remebee voor. Hayes was voorzitter van de Apiary Inspectors of America, maar hij was vooral de geliefde auteur van de rubriek The classroom in het American Bee Journal, die hij al 25 jaar verzorgde. Ze kwamen overeen om een veldproef op te zetten in Florida, de thuisbasis van Hayes. In Californië deed ook de bij ons beter bekende Randy Oliver mee. We schrijven 2009. Alles gebeurde onder de strikte controle van de Drugs and Food Administration. De proeven hielden in dat een groep volken met het Israëlisch acuut verlammingsvirus werd besmet. De ene helft kreeg een portie Remebee, de andere helft niet. Uit labo- en kooiproeven was inmiddels gebleken dat Remebee niet enkel hielp tegen het Israëlisch acuut verlammingsvirus maar tot op zekere hoogte ook tegen de verwante Kashmir- en chronisch verlammingsvirussen (Scientificbeekeeping.com).

Aan het einde van de veldproef schreef een tevreden Randy Oliver: ‘De onderzoekers vertelden me niet welke volken het middel gekregen hadden en welke niet, maar het was niet moeilijk om tijdens de proeven al te zien welke groep met Remebee behandeld werd en welke groep niet’.

Beeologics toonde ook aan dat parasieten als Nosema ceranae d.m.v. RNAi kunnen aangepakt worden. Dat ging evenwel om labo-onderzoek dat bij ons weten achteraf niet op het terrein werd geëvalueerd (Huang et al., 2015).

… Monsanto

Beeologics kreeg al snel de aandacht waar Ben-Chanoch op gehoopt had. Berichten over de aanstaande ‘betaalbare oplossing’ van Beeologics voor CCD trokken de aandacht van leidinggevenden bij Monsanto. Of ‘Mon-satan’ zoals sommigen het woord uitspreken. Het bedrijf werkte al aan een RNAi-verbeterde maïsplant om de Westerse wortelworm uit te schakelen en zag mogelijkheden in de aanpak van Beeologics. ‘Als je een ideaal bestrijdingsmiddel zou willen ontwerpen, dan is het dat wat je zoekt’, zei Pamela Bachman, toxicologe bij Monsanto, ‘traditionele bestrijdingsmiddelen werken als een soort chemische graafmachine, ze doden weliswaar hun doelen (kevers, onkruid, micro-organismen) maar schaden daarbij niet-geviseerde organismen (nuttige insecten, vogels, vissen, …). RNAi heeft de precisie van een  scalpel, het schakelt zijn ‘slachtoffers’ uit door te klikken op de sequenties van genetische codes die uniek zijn voor dat organisme’.

Hayes’ parcours bij Monsanto

Niemand schrok dan ook toen Monsanto in 2011 Beeologics overnam. Verrassender was dat de onderneming good guy Jerry Hayes aanzocht om Remebee verder mee te ontwikkelen, maar die aarzelde. Monsanto en de imkerij verhielden zich immers als water tot vuur. Hij wist zichzelf een milieuactivist die er evenwel van overtuigd was dat de bijensterfte niet veroorzaakt werd door de neonicotinoïden en dat milieuorganisaties dat soort toestanden misbruiken om geld en macht te verwerven. Hij begreep dat Monsanto de technische en financiële middelen had om de imkerij te helpen om de bijensterfte te overwinnen. Dus nam hij de job aan. Onbegrip in imkerskringen was zijn deel. ‘We dachten dat hij geld nodig had’, zei Marla Spivak hierover veelbetekenend…

Hayes moest vaststellen dat de ontwikkeling van Remebee niet zo ver stond als hij had verwacht. Toen bleek dat labo-onderzoek (Garbian et al., 2012) intussen had aangetoond dat ook de varroa via RNAi kon bestreden worden, overtuigde hij zijn bazen om het onderzoek naar het nut van RNAi tegen virussen stop te zetten en over te schakelen naar de bestrijding van de varroamijt op basis van dezelfde technologie.

In 2013 richtte hij voor rekening van Monsanto de Honeybee Health  Coalition op (https://honeybeehealthcoalition.org/). Bedrijven, universiteiten en imkerverenigingen sloten zich aan met het doel de krachten te bundelen ten voordele van de honingbij.

Intussen waren zijn echtgenote en twee van zijn kinderen naar Missouri overgekomen. Maar het leven spaarde Hayes niet. Zijn echtgenote werd er ziek en stierf in april 2014 aan kanker.

Hayes werkte voort. Zijn team slaagde erin om dsRNA samen te stellen dat mRNA van vitale genen van de varroamijt blokkeerde. In 2016 startte hij met de wellicht grootste veldproef ooit in de imkerij. Meer dan 1000 volken van overal in Amerika namen eraan deel. De bedoeling hiervan was de methode te testen in alle mogelijke klimaatomstandigheden. De eerste resultaten werden eind 2016 verwacht, maar Monsanto besliste de proef door te laten lopen tot diep in 2017. In juli 2018 ging Hayes met pensioen (Hannah Nordhaus, 2016).

Verder onderzoek nodig

RNAi is dan wel een doeltreffend middel tegen virussen, maar recente studies toonden aan dat het ook bij bijen niet-gewilde effecten kan veroorzaken en dat het middel mogelijk niet altijd effectief is bij het onderdrukken van het virus. Redenen daarvoor kunnen zijn de levensfase van de bij, de stabiliteit van de nucleotidensequentie van het geviseerde gen, de hoeveelheid toegediende dsRNA (DaheYang et al., 2018), of nog bestaande hoge virusbesmetting (De Smet et al., 2016), …

RNAi, quo vadis?

Nadat Beeologics in 2007 een patent verwierf voor Remebee, gebaseerd op dsRNAi van het acuut verlammingsvirus, volgden succesrijke veldproeven o.a. in Californië (Randy Oliver) en Florida (Jerry Hayes).

In 2011 vonden testen plaats met RemebeePro, een dsRNA-cocktail die meerdere virussen tegelijk te lijf kon gaan.

De resultaten van deze proeven waren bemoedigend en vertoonden alle hetzelfde beeld: sterkere volken die meer honing oogstten. Over de effecten op andere genen dan die waarvoor het dsRNA gemaakt werd was toen nog weinig of niets bekend. Dat verklaart waarom de Foods and Drugs Administration Remebee alsnog niet erkende. Het belette Monsanto niet om Beeologics in 2012 over te nemen. Nadat de onderneming het RNAi-onderzoek richting varroamijt had uitgestuurd, vonden Hayes en zijn team bij varroa al snel genen waarvan ze het mRNA konden blokkeren. Maar de eerste proeven vielen tegen. Slechts 20 % van de mijten stierven aan de toegediende dsRNA-siroop.

Hayes werkte voort en boekte vooruitgang. Dat bleek uit de veldproeven van 2016 waarover we het al hadden. De resultaten varieerden evenwel. Soms werkte het middel goed, soms niet. De onderzoekers wisten niet meteen waarom dat zo was. Het was mogelijk dat de bijen het dsRNA ongelijk in het volk verspreidden. ‘We denken dat RNAi werkt op mijten in het broed, eerder dan op die welke op de bijen zitten” zei Hayes en ‘wellicht nemen de voedsterbijen de suikersiroop op en voeden ze die aan de larven. Het hele proces is mogelijkerwijs ook afhankelijk van omgevingsfactoren, bv. of er een dracht aan de gang is of niet’.

Hiermee kenden de onderzoekers hun volgende uitdaging: achterhalen wat de verschillen in werkzaamheid veroorzaakte. Ze beslisten de proef in 2017 verder te zetten (McAfee, 2017).

Over de resultaten hiervan zijn er op het Internet geen gegevens te vinden. Sinds Bayer Monsanto overnam is de verdere ontwikkeling van het product ondergebracht in de divisie BioDirect Technologies. ‘Dit baanbrekend onderzoek is gerijpt tot fase 3 van onze onderzoeks- en ontwikkelingspijplijn’ staat er te lezen op de website van de multinational. En verder: ‘Naar verwachting zullen we blijven onderzoeken hoe een natuurlijk proces genaamd RNAi kan worden ontwikkeld tot een middel dat honingbijen helpt om de mijt en andere ziekten het hoofd te bieden.’

De divisie is eveneens gaan samenwerken met de University of Florida en de onderzoeksstaf van het Amerikaanse ministerie van Landbouw, het zogenaamde Agriculture Research Service, onder het motto: ‘Dit probleem is te groot, te belangrijk en te complex voor één bedrijf of groep – we moeten samenwerken’.

Niet enkel RNA-interferentie

Behalve RNAi bestaat het afweermechanisme van bijen tegen virussen o.a. ook uit fagocytose, melanisatie, nodulatie en reactiepaden als bv. Toll (McMenamin et al., 2018). Deze items vallen evenwel buiten de scoop van deze bijdrage.